Transfer of Wild-Type Plasmids Harbouring Tetracycline or Erythromycin Resistance Genes from Native Strains of Lactobacillus plantarum to other Bacteria in a Gastrointestinal Environment

Overførsel af oprindelige plasmider indeholdende tetracyklin eller erythromycin resistensgener fra naturligt forekommende Lactobacillus plantarum stammer til andre bakterier i et tarmmiljø Denne rapport omhandler overførsel af plasmider vha. konjugation fra naturlige laktobaciller til andre bakterier af relevans for den humane tarm. Plasmiderne indeholder gener, der koder for resistens overfor tetracyklin eller erythromycin. Konjugativ overførsel og faktorer som påvirker overførslen er blevet undersøgt in vitro, samt i forskellige dyremodeller, der simulerer den humane mave-tarm kanal. Det eksperimentelle arbejde omfatter aspekter, som forsøger at kaste lys over omfanget af laktobacillers medvirken til udbredelse af antibiotikaresistensgener. Dette inkluderer både overførselsfrekvenser der giver et skøn af den kvantitative udbredelse, samt ruter for overførsel, herunder hvilke bakterier der optræder som mulige recipienter. En vurdering af antibiotikas selektive virkning, både i koncentrationer under det hæmmende niveau og i koncentrationer der simulerer kliniske niveauer, er også medtaget. Derudover, er der antaget et mere mekanistisk synspunkt med fokus på de genetiske faktorer for plasmider, der bl.a. er ansvarlige for overførsel, bestemmelse af værtsspektrum, ekspression af antibiotikaresistens og regulering af replikation. Denne rapport består dels af et teoretisk sammendrag baseret på tilgængelig litteratur indenfor området og dels af tre manuskripter, som redegør for vigtige udvalgte resultater opnået gennem projektet. Hovedområderne i den teoretiske del er brug og virkemåder af antibiotika samt udvikling af antibiotikaresistens, inklusive ruter for udbredelse og resistensmekanismer. Derudover findes et afsnit omhandlende genoverførsel hos bakterier, hvor der bliver set mere i detaljer på den basale genetik for mobile DNA elementer samt interaktioner med deres bakterielle værter. Endeligt diskuteres overførsel af antibiotikaresistensgener i det humane mave-tarm system samt specifikke modeller, der kan anvendes til at studere dette. I den teoretiske oversigt bliver der sat ekstra fokus på tetracyklin og erythromycin samt på laktobaciller, konjugation og rolling-circle replikerende plasmider, idet de praktiske studier specielt har koncentreret sig om dette. 6 Manuskript I, havde til formål at teste to naturligt forekommende Lactobacillus plantarum stammers (DG 507 og DG 522, isoleret fra belgiske fermenterede pølser) evne til at fungere som donorer af oprindelige plasmider indeholdende erythromycin og tetracyklin resistensgener i et mave-tarm miljø. Kimfri rotter blev inokuleret med en Enterococcus faecalis recipient og brugt som model til at efterligne et scenarie for højst tænkelig overførsel i den humane mave-tarm kanal. Efter kolonisering med recipienten blev hver af donorstammerne introduceret og efter to dage kunne transkonjuganter detekteres i fæcesprøverne. Dette studie dokumenterede begge L. plantarum stammers evne til at overføre antibiotikaresistensgener vha. konjugation efter påvirkning af fysiske faktorer, svarende til dem der findes i den humane mave-tarm kanal. I Manuskript II, blev overførsel af det naturligt forekommende plasmid pLFE1, indeholdende et erythromycin resistensgen, studeret i en di-associeret rottemodel, som beskrevet for manuskript I. Først blev rotterne koloniseret med en E. faecalis recipient og derefter blev donorstammen L. plantarum M345 (isoleret fra en fransk råmælksost og indeholdende pLFE1) introduceret. Udbredelsen af pLFE1 blev undersøgt i tre grupper af rotter, der henholdsvis blev behandlet med erythromycin i koncentrationer der simulerer klinisk behandling, 1/10 af klinisk behandling eller ingen behandling. Transkonjuganter blev observeret i alle tre grupper, men overførslen og etableringen af pLFE1 var tydeligt forbedret i de grupper, der havde modtaget erythromycin – uanset dosis størrelse. Stort set alle E. faecalis recipienter modtog pLFE1 indenfor den første dag i erythromycin-behandlede rotter, hvorimod det varede 4-5 dage at nå en stabil population og i et signifikant lavere antal for de ubehandlede rotter. Den stærke selektion af pLFE1 forårsaget af erythromycin kan foruden vækstfordelen muligvis forklares med en øget overførselsfrekvens. Selektivt pres med erythromycin var dog ikke en forudsætning for opretholdelse af pLFE1, da antallet af transkonjuganter i tarmen forblev relativt stabilt selv 12 dage efter endt antibiotikabehandling. Mave-tarm kanalen udgjorde tilsyneladende et mere favorabelt miljø for konjugativ overførsel af plasmider end in vitro, idet et relativt højt antal transkonjuganter (10-4 transkonjuganter/recipient) kunne observeres in vivo, selv i ubehandlede rotter, til trods for en lav overførselsfrekvens in vitro (~5.7 × 10-8 transkonjuganter/recipient). For at undersøge overførsel af pLFE1 i en mere kompleks model med en svækket koloniseringsmodstand, blev et tilsvarende forsøg udført med streptomycinbehandlede mus. I dette forsøg kunne der ikke detekteres nogen overførsel til E. faecalis recipienten, hvilket understreger den naturlige mikrobiotas evne til at reducere overførsel. 7 I Manuskript III, blev den 4031 bp lange nukleotidsekvens for det lille pLFE1 plasmid bestemt og analyseret. Sekvensen rummede et erm(B) gen kodende for en erythromycin ribosom methylase, der giver resistens overfor erythromycin, og et lille erythromycin leader peptid, hvis tilstedeværelse antydede at ekspression af resistensen kan være inducerbar. Plasmidet pLFE1 tilhører angiveligt pMV158 familien af rolling-circle replikerende (RCR) plasmider, indeholdende et potentielt replikationsprotein, RepB, som er karakteristisk for denne familie. To elementer (et protein CopG, som undertrykker transskription og et lille RNA (ctRNA) transskriberet i modsat retning), der typisk er involveret i kontrol af RepB og dermed antal plasmidkopier i pMV158 familien, kunne også detekteres. Et muligt område for initiering af replikation, indeholdende et origin for dobbeltstrenget DNA, der er kompatibelt med RepB og et origin for enkeltstrenget DNA, blev identificeret. Derudover blev tilstedeværelsen af et sekundært område for initiering af replikation foreslået. En sekvens kodende for et potentielt trunkeret mobiliseringsprotein i lighed med Pre/Mob proteiner fra pMV158 familien blev også fundet. Dette protein blev dog ikke regnet for funktionsdygtigt, og derfor formodedes det, at mobilisering af pLFE1 kræver et andet Mob protein i trans. Analysen af nukleotidsekvensen blev ledsaget af filter-mating studier, for at undersøge hvorvidt pLFE1 kan overføres til og replikere i andre arter af Gram-positive bakterier. Det blev vist at pLFE1 har et bredt værtsspektrum, idet der blev observeret transkonjuganter fra mating mellem donorstammen L. plantarum M345 og recipienter af Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis, Listeria innocua, E. faecalis og Listeria monocytogenes.