Responses of KT2440 Pseudomonas putida to mild water stress

Vandmangel er en vigtig potentiel stressfaktor i mange naturlige eller konstruerede mikrobielle miljøer. I umættede jorde er tilgængeligheden af vand kontrolleret af matric potential (!m). Sammen med poregeometrien styrer !m tykkelsen af de tynde væske-film, der dannes i jordens porer. En vigtig faktor for bionedbrydningen af forurenende stoffer i jord er, at bakterier og forurenende molekyler er i kontakt med hinanden. Når betingelserne bliver mere umættede (dvs. mere negativ !m), bliver væske-filmen så tynd, at vandets veje bliver afbrudt, hvilket fører til begrænsning af bakteriel motilitet og dermed begrænsning af diffusion af de forurenende stoffer i jordens porer. Som reaktion på vandmanglen udviser bakterier forskellige former for adaptiv respons såsom produktion af ekstracellulært polymert stof (EPS). Tidligere undersøgelser indikerer, at EPS gør mikro-kolonier i stand til at bevare deres hydrerede tilstand i længere tid efter udtørring af jorden. Denne effekt kan være gavnlig for fjernelse af forurenende stoffer, da det ville sikre en løbende fjernelse under umættede forhold samt hurtig genopretning efter tilbagevenden til mættede betingelser. I denne afhandling blev betydningen af flagellær motilitet og produktion af EPS under matric stess undersøgt ved brug af den såkaldte Porous Surface Model (PSM), som genererer væske-filmens effekter ved kontrol af !m. Det blev vist, at flagellær motilitet var begrænset under matric stress; Pseudomonas putida KT2440 kolonier udviste væsentlig højere vækstrater tæt ved mætningsbetingelser (-0.5 kPa !m) end kolonier dyrket under matric stress (ved -3.6 kPa !m). Desuden viste 1:1 kompettitive eksperimenter med begge phenotyper ved mættede betingelser, at den naturligt forekomne KT2440 udkonkurrerer dens ikke-flagellare mutant med hensyn til overflade-kolonivækst, hvorimod begge phenotyper sameksisterer under matric stress (-3.6 kPa). Denne afhandling har endvidere vist at bakterierne kunne drage fordel af pludseligt forekomne mættede betingelser (5 minutter, to gange dagligt) idet flagellær motilitet blev observeret. Dette resultat indikerer, at selv sjældent forekomne mættede betingelser kan mindske omkostningerne forbundet med flagellær syntese og dermed forklare den vedvarende tilstedeværelse af flagelceller i jordmiljøer. Vækstrater og morfologi blev undersøgt for forskellige EPS-manglende mutanter af bakterien P. putida KT2440. De indledende resultater med mutanterne viste ingen signifikante forskelle i vækstrater og morfologi for hhv. naturligt forekomne KT2440 og alginat-manglende (et væsentligt EPS) mutanter under våde (-0.5 kPa) og tørre (-0.4 MPa) betingelser. Dette indikerer, at alginat ikke har nogen effekt på overflade-kolonidannelse under matric stress. Et af hovedformålene med denne afhandling var at forbedre PSM-metoden, således at rækken af matric potentials udvides (dvs. ned til -1.5 MPa, vegetations-visnings-punktet), idet det nuværende spektrum af matric potentials, der kan genereres med PSM-metoden, er smalt og nærmest begrænset til 1 m H2O (10 kPa). Med dette formål modificerede vi PSM-metoden, sådan at den ønskede !m kan fastsættes svarende til den negative værdi af det givne pneumatiske tryk. Denne modificerede model har vi kaldt Pressurized Porous Surface Model (PPSM). Gennem validering af bakterievækst og målbare genudtryksniveauer har vi vist, at PPSM kan anvendes til at studere bakteriers adfærd under et bredt spektrum af matric potentials. Endelig blev den fuldstændige genudtryknings-dynamik for Pseudomonas putida KT2440 under matric stress klarlagt. Vi identificerede de forskelligt udtrykte gener efter 4, 24 og 72 timer ved -0.4 MPa !m relativt til nær-mætningsbetingelser (-0.5 kPa). Selvom vores hypotese var at flagellære gener ville nedreguleres under matric stress, detekterede vi signifikant opregulering af alginat-syntese-gener. Dette indikerer, at matric stress spiller en afgørende rolle i udtrykningen af flageller. Den observerede opregulering af alginat-syntese-gener understøtter vores hypotese om betydningen af alginat under umættede betingelser og er desuden i overensstemmelse med tidligere undersøgelsers resultater. Desuden evaluerede vi hvorvidt vandpotentialeeffekter simuleret via polyethylen-glycol (PEG-8000), med en molekylevægt på 8000 Da, kan udgøre gode estimeringer af direkte matric potential mht. fuldstændig genudtrykning af KT2440. Vores undersøgelser viste, at vandtryk simuleret via PEG-8000 resulterede i en anderledes genudtryksprofil end for direkte anvendt matric stress. Overordnet har denne afhandling vist betydningen af flagellær motilitet og EPS med hensyn til matric stress. Disse resultater bidrager væsentligt til forståelsen af interaktionerne mellem mikroorganismer og forurenende stoffer i den umættede zone.