Novel tools for ultra-specific targeting of nucleic acids

Maria Taskova*

*Corresponding author for this work

Research output: Book/ReportPh.D. thesis

Abstract

Med udviklingen af phosphoramidit syntesen blev brugen af syntetiske oligonukleotider øget markant. Korte oligonukleotider har fundet bred anvendelse i forskellige forskningsområder grundet deres regelmæssige struktur og specifikke interaktioner. Disse inkluderer kemisk biologi, biomedicin og klinisk diagnostik. Modifikationer af oligonukleotiders kemiske struktur har ledt til udviklingen af mere stabile og effektive sekvenser med større potentiale som lægemidler og diagnostiske værktøjer til klinisk brug.
Kapitel 3, 4 og 5 i denne afhandling beskriver syntesen og karakterisering af avancerede oligonukleotid-lægemidler. Vi syntetiserede et bibliotek af peptid-oligonukleotid konjugater (POC) som modellægemidler, og undersøgte deres biofysiske egenskaber in vitro. Vores resultater bekræftede, at konjugaterne binder effektivt til deres komplimentære sekvens og kan identificere sekvenser med mutation på én enkelt nukleobase. Ydermere viste stabilitets studier i plasma, at konjugaterne har øget stabilitet sammenlignet med de frie oligonukleotider. En række komplekser og konjugater blev derefter formuleret, hvor oligonukleotiderne blev kombineret med peptider og proteiner. Formuleringerne blev testet i forskellige simulerede biovæsker, hvor resultaterne viste, at begge strategier øger stabiliteten af oligonukleotiderne, men. Konjugering med peptiderne var mere effektivt end kompleksering. Detaljeret analyse viste hvordan sekvensen af de konjugerede peptider ændrede stabiliteten af oligonukleotiderne i simuleret mave syre. Slutteligt blev en serie af terapeutiske oligonukleotider designet til at reducere HIV1-mRNA eller BGas lnRNA ekspression og funktion. Oligonukleotiderne blev komplekseret og konjugeret med peptider og testet i cellestudier, hvilket viste lovende resultater med forbedret optag i cellerne. Der var dog stor variation i de kvantitative resultater.
Kapitel 6 omhandler udviklingen af en simpel og omkostningseffektiv metode til at funktionalisere og modificere oligonukleotider som fluorescente værktøjer til diagnostik. Ligeledes bliver de biofysiske studier samt muligheden for at identificere mutationer af enkelte nukleobaser beskrevet. Vi syntetiserede en ny bis-alkyn nukleinsyre byggeblok, som efterfølgende blev inkorporeret i en oligonukleotid sekvens. Derefter blev sekvensen konjugeret med 3 fluorescente farvestoffer. Ifølge vores resultater er oligonukleotid-farvestofkonjugatet med perylen i stand til at identificere mutationer af enkelte nukleobaser via interkalering i det resulterende duplex, hvilket ændrer intensiteten ved emissionens maksimum. Lignende effekter blev ikke observeret for konjugater med 5JOE eller PEP farvestoffer. Ydermere var perylen-konjugatet i stand til at detektere muteret DNA ekstraheret fra cancer celle linjer.
Original languageEnglish
Place of PublicationKgs. Lyngby
PublisherTechnical University of Denmark
Number of pages183
Publication statusPublished - 2019

Cite this

Taskova, M. (2019). Novel tools for ultra-specific targeting of nucleic acids. Kgs. Lyngby: Technical University of Denmark.