Molecular Dynamics Simulations of Escherichia coli Ammonia Channel AmtB

Denne afhandling omhandler molekyldynamiske (MD) simuleringer af E.coli Ammoniakkanalen AmtB, som tilhører AMT familien af transmembrane ammoniak/ ammonium (Amm) transporterende proteiner. Ammoniak (NH3), som i dets protonerede form er ammonium (NH+4 ), er en vigtig næringskilde for mikroorganismer og planter. I pattedyr er Amm hovedsagligt et stofskifteaffaldsprodukt, men har dog ogs°a nogle vigtige funktioner bl.a. i nyrerne, hvor udskilning af NH+4 til urinvejene er med til at regulere syre-base balancen i blodet. Dog er Amm giftigt i forhøjede koncentrationer der som oftest er en følge af nedsatte Amm reguleringsfunktioner i kroppen, f.eks. nedsat nyrefunktion, og menes at være en medvirkende °arsag til hjernelidelser s°a som Alzheimer type II. At Amm-regulering og -transport er fysiologisk vigtige mekanismer afspejles af, at alle levende organismer har proteiner tilhørende AMT familien siddende i deres cellemembraner. I mennesket har det vist sig, at Rhesus proteinerne, som hovedsageligt kendes fra Rhesusblodtypesystemet og deres medvirken til røde blodlegemers immunreaktion, ogs°a tilhører AMT familien. AMT proteiners funktion i Amm-transport over cellemembraner gør dem bl.a. interessante i forbindelse med optimering af nitrogenoptagelse/-udnyttelse i mikroorganismer og planter, hindring af nitrogenoptagelse i sygdomsfremkaldende mikroorganismer, samt i forbindelse med sygdomme, der skyldes en nedsat transportfunktion af Rhesus-proteiner. Derfor er det vigtigt at forst°a transportmekanismen i detalje, dvs. helt ned p°a atomart niveau at forst°a sammenhængen mellem proteinstruktur og -funktion. I den forbindelse spiller proteinbevægelser (dynamik) en stor rolle, og MD simuleringer har mange gange tidligere vist sig som et værdifuldt værktøj til at opn°a den ønskede forst°aelse. Som den første AMT proteinstruktur blev røntgenkrystalstrukturen af AmtB betemt i 2004. Forst°aelse af sammenhængen mellem proteinstruktur og -funktion af et AMT protein kan forventes at give en generel forst°aelse af hele familien. Da MD simuleringer forudsætter god strukturel information, var det oplagt at undersøge disse sammenhænge vha. MD simuleringer af AmtB. Det blev derfor emnet for mit Ph.D.-projekt, som nu afsluttes med denne afhandling. Nogle vigtige spørgsm°al, som ønskes besvaret omkring funktionen af AmtB, og AMT proteiner generelt, er bl.a. følgende: 1 ) Hvordan rekrutterer AmtB substratet ammoniak/ammonium? 2 ) Hvordan genkender AmtB substratet? Og da eksperimenter tyder p°a, at NH+4 rekrutteres, mens NH3 transporteres, s°a 3 ) hvor og hvordan deprotoneres NH+4 ? Hovedresultaterne beskrevet i afhandlingen kan sammenfattes i en besvarelse p°a disse spørgsm°al. Hvordan rekrutterer AmtB substratet ammoniak/ammonium? Modsat tidligere fremsatte hypoteser om at aromatiske fenylalanin-sidekæder (F107 og W148) vha. s°akaldte kation- vekselvirkninger spiller en meget vigtig rolle i at rekruttere positivt ladet substrat, s°asom NH+4 , fremfor neutralt substrat, s°asom NH3, viste simuleringsresultaterne, at disse ikke har særlig stor betydning i s°a henseende. Modsat viste simuleringerne, at den deprotonerede asparaginsyre-sidekæde (Asp160), som tidligere kun var tillagt en proteinstruktur-stabiliserende funktion, derudover ogs°a har stor betydning for at rekruttere NH+4 fremfor NH3. Simuleringerne afslørede samtidigt, at et karbonyloxygen (A162:O) er vigtig for rekrutteringen af NH+4 og videre transport. Hvordan genkender AmtB substratet? Tidligere eksperimenter har indikeret at de fysiologisk vigtige natrium- og kaliumioner fravælges af AmtB og at deres tilstedeværelse ikke har betydning for rekrutteringen af NH+4 . Det er interessant da kaliumionen er af samme størrelse og ladning som NH+4 , og derfor skulle formodes at blive rekrutteret. Igen viste det sig A162:O spillede en vigtig rolle ved kun at binde kationer, som indeholder brint, men ikke metal ioner. Derudover viste simuleringerne, at en glutamin-sidekæde (Q104) kan stabilisere NH+4 ved at polarisere et vandmolekyle bundet til substratet, men muligvis ogs°a kan hindre større ioner s°asom methylammonium (CH3NH+3 ) i at binde liges°a godt som NH4+. Hvor og hvordan deprotoneres NH+4? Tidligere eksperimenter har vist, at den brintion (H+), som spaltes fra n°ar NH+4 deprotoneres, ikke transporteres igennem AmtB. P°a baggrund af indledende simuleringer blev der forsl°aet en mekanisme, som kunne forklarer denne observation. Efterfølgende blev den estimerede position, hvor deprotonering finder sted, bekræftet vha. af energetiske beregninger baseret p°a s°akaldte styrede MD simuleringer, hvor NH3 og NH+4 blev trukket igennem kanalen. Selve mekanismen, som involverer ovenfor nævnte A162 og D160, blev dernæst testet vha. af en special type MD simulering, hvor dele af systemet behandles kvantemekanisk. Den foresl°aede mekanisme kunne dog hverken be- eller afkræftes.