Establishment of Yeast Platform for Isoprenoid Production

Mohammadali Asadollahi

    Research output: Book/ReportPh.D. thesis

    264 Downloads (Pure)

    Abstract

    Isoprenoider er navnet på en kemisk stofgruppe og består af en diverse samling af naturligt forekomne forbindelser. De udfylder en lang række af biologiske og økologiske funktioner, og mere end 40,000 eksempler er beskrevet i litteraturen. Målet med dette Ph.D. studie har været at etablere en produktionsplatform i bagegær, Saccharomyces cerevisiae, for en undergruppe af Isoprenioder kaldet sesquiterpener. Ekspression af tre forskellige sesquiterpen gener fra planter, valencene synthase, cubebol synthase samt pathchoulol synthase, resulterede i akkumulering af de forventede sesquiterpener i vækstmediet, men det blev samtidig konstateret at en stor del af disse forbindelser grundet deres flygtige egenskaber blev tabt via afgangsgassen under dyrkningsprocessen. Dette dannede grundlag for udviklingen af en to-fase gæringsproces hvori dodecane bliver anvendt som anden fase, og denne teknik blev efterfølgende anvendt til karakterisering af de udviklede sesquiterpene producerende gærstammer under de i projektet udførte gæringsforsøg. I det næste udviklingstrin blev regulering af mevalonate stofskiftet afkoblet i et forsøg på at ændre den intercellulære koncentration af farnesyl diphosphat (FPP), der udgør udgangspunktet for sesquiterpene biosynthesen. Denne afkobling blev gennemført ved ændring af udtrykket af to af de mest betydningsfulde regulatoriske gener i mevalonate stofskiftet, kaldet ERG9 og HMG1. For at opnå reduceret udtryk af genet ERG9 blev den oprindelige promoter udskiftet med den svagere og inducerbare MET3 promoter, og i nærvær af aminosyren methionin blev et reduceret indhold af stoffet ergosterol målt i cellerne. Desuden blev der målt akkumulering af sesquiterpener og farnesol som er et biproduct af FPP. Overudtryk af det katalytiske domæne af HMG-CoA reduktase, der kodes af genet tHMG1, resulterede også i akkumulering af squalener og højere koncentrationer af cubebol. Videre undersøgelser baseret på anvendelse af in silico metoder (metabolic engineering) identicerede to nye gener, hvis fjernelse kunne forbedre biosyntesen af sesquiterpener i gær. Fjernelsen af genet GDH1, der koder for det NAPDH-afhængige enzym glutamat dehydrogenase, der blev identificeret via den tidligere beskrevne fremgangsmåde, resulterede i et betydeligt højere udbytte af cubebol. Afslutningsvis blev rekombinant produktion af lycopene i S. cerevisiae undersøgt gennem udtryk af de kodon-optimerede gener crtE, crtB og crtI fra bakterien Erwinia herbicola, og udtryk af de tre karoten-gener medførte akkumulering af lycopener. Effekten af nedregulering af ERG9 og overudtryk af tHMG1 i forbindelse med produktionen af lycopene blev ligeledes undersøgt.
    Original languageEnglish
    Number of pages154
    Publication statusPublished - Sep 2008

    Cite this