Enzymatic Production of Ceramide

Ceramid og ceramidderivat har skabt stort interesse som aktive komponenter både indenfor lægemiddels og kosmetikindustrien. Dette projekt er et studie af enzymatisk produktion af ceramid. Hoveddelen af afhandingen fokuserer på enzymatisk hydrolyse af sphingomyelin (SM). Naturlig SM fra forskellige kilder er blevet hydrolyseret ved hjælp af enzym opløst i vandig opløsning, enzym immobiliseret til partikulære carriers og enzym immobiliseret til membran. Der er hovedsagligt brugt et to-fas system (vand:organiske solvent) til de enzymatiske reaktioner og de brugte reaktionsvolumen varierede mellem 0,2 til 79 ml. Effekten af flere forskellige parametre på reaktionseffektivitet blev undersøgt ved at applicere response surface methodolog (RSM) i den eksperimentelle design og data analyse. High performance thin-layer chromatography er blevet brugt som hovedsagelig kemiske analysemetode. I afhandlingen indgår også et afsnit om syntese af særskilte ceramidstrukturer. Når reaktionen skedte som en single-batch reaction, var SM hydrolys effektivere i et to-fas system (vand:organisk) end i et en-fase system (vand-mætted organisk solvent).. Ud af de undersøgte enzymer, viste sig phospholipase C (PLC) fra C. perfringens have mest gunstige egenskaber. Tilsætning af ethanol til system øgede SM hydrolyse hastigheden og en blanding af ethylacetat og hexan (50:50 af vol.) viste sig vare det bedste organiske system. Når hydrolysen blev optimeret med hensy til 5 faktorer vha RSM havde mængden vand og enzym i systemet, den mest signifikante effekt på hydrolysehastighed i en ”fitted quadratic model. Reaktionshastigheden af SM hydrolyse var hurtigere i en Tris-HCl end i en buffer blanding som kunne benyttes i et meget bredt pH-interval (2-12). En forøget koncentration af Tris-HCl havde dog en negativ indvirkning på SM hydrolyse reaktionen. For at forbedre mulighederne at genbruge enzymet, undersøgtes immobilisering af PLC samt det immobiliserede enzyms egenskaber. I en undersøgelse af forskellige carriers, havde det immobiliserede enzyme højst aktivitet på Lewatit VP OC 1600 (Lew). Det var muligt at forøge mængden bundet enzym på Lew partiklerne, men samtidigt mindskede enzymaktiviteten. Mere enzym blev bundet til partiklerne, når den initiale enzymkoncentration øgedes, og samtidigt steg den specifikke aktivitet. Den optimale temperatur for katalyse af reaktionen var omkirng 46 oC og det optimale vandindhold var 3.5 %. Reaktionen havde en meget lav pH afhængighed. Efter 7 cykler, bibeholdt det immobiliserede enzym omkring 70 % af den initiale aktivitet. Ved immobilisering til magnetiske partikler, faldt reaktionshastigheden markant. Varmeinaktivering af enzymet ved 65 oC fulgte ikke første ordningens kinetik i opløsning, som puder eller når det var immobiliseret til partikulære carriers. Både opløst og immobiliseret PLC fulgte Michaelis-Menten kinetik. Immobiliseringen sænkede Vmax markant, uden at fore til en nævneværdig forandring af Km. som om immobiliseringen førte til en non-kompetetiv inhibering. Produktet, ceramid, aktiverede hydrolysereaktionen, studierne af kinetikken viste at dette primært skyldes en øget affinitet i substrat-enzym komplekset. Ved udviklingen af en membranreaktor til SM hydrolyse, separeredes den vandige og organiske fase af en membran som indhold de immobiliserede enzym, i mens den organiske fase cirkulerede kontinuerligt. Bland det ti membran som blev afprøvede, bibeholdt enzymet i membranen RC 70PP, men med lav immobiliserings effektivitet. Når tre immobiliserings metoder, filtrering, kovalent binding samt cross-linking sammenlignedes, havde enzym som var immobiliseret ved filtrering den højeste aktivitet med lav immobiliserings effektivitet. Den optimale cirkulationshastighed for den organiske fase var 5 ml/min. Efter fem reaktionscykler, bibeholdt enzymet 16 % af den oprindelige aktivitet. Membranreaktoren forbedrede muligheden at genbruge enzymen, havde en hurtig immobiliserings proces, er let at opskalere og gjorde det muligt at kombinere hydrolysereaktionen med produktseparation. Flere forskellige mulige metoder til syntese af mere komplicerede ceramider foreslås. Samtlige metoder indeholder enzymatisk acylering af sphingosin som et nøgle-trin. Der blev vist at dette er en muligt ved brug af et rekombinant humant neutralt ceramidase. Efter 24 timers reaktionstid opnåedes et udbytte på 50 %. Sammenfatningvis har dette studie ført til udvikling af en effektiv og skalerbar metode til enzymatisk production af ceramid og vigtig, ny og detailleret viden som kan bruges til industrielle applikationer er blevet genereret.