Cellekulturer danner blod-hjerne-barrieren i laboratoriet

Karin Lauschke*, Camilla Victoria Lindgren Schwartz

*Corresponding author for this work

Research output: Contribution to journalJournal articleResearchpeer-review

Abstract

Viden om blod-hjerne-barrierens komposition og gennemtrængelighed er essentiel for udviklingen af lægemidler, der skal kunne nå hjernens celler, men også for forskning i neurodegenerative sygdomme. Studier indikerer nemlig, at der er sammenhæng mellem intaktheden af blod-hjerne-barrieren og sygdomme som eksempelvis vaskulær demens, multipel sklerose og Alzheimers sygdom.1-4 Hvorvidt nedbrydning af blod-hjerne-barrieren er årsag eller konsekvens vides ikke.

Til at undersøge blod-hjerne-barrieren kræves gode modeller, der kan laves i laboratoriet. Det kan enten være dyremodeller eller modeller baseret på celler groet i kulturskåle – såkaldte in vitro modeller. Denne artikel giver et overblik over forskellige eksisterende modeller, samt hvad der skal til for, at vi i fremtiden kan udvikle fysiologisk relevante modeller af blod-hjerne-barrieren.

Blod-hjerne-barrierens komposition
Blod-hjerne-barrieren er en tæt barriere, der adskiller hjernemiljøet fra blodsystemet. Den består af flere forskellige celletyper, der tilsammen har til opgave at selektere, hvilke stoffer der får lov at passere fra blodet og ind i hjernen for at sikre det helt unikke miljø, der kræves for, at hjernens celler kan fungere optimalt. Blod-hjerne-barrierens unikke tæthed og selektive permeabilitet skyldes tre forskellige celletyper.

Det basale cellelag udgøres af specialiserede endothelceller. Disse celler udtrykker særlige proteinkomplekser (tight junctions og adherens junctions) på deres laterale overflade, hvilket har til funktion at binde cellerne tæt sammen og derved skabe en fysisk barriere, der forhindrer molekyler i at passere imellem cellerne fra blodet og ind i hjernevævet. I stedet må molekylerne passere igennem cellerne ved hjælp af forskellige aktive transportmekanismer, der sørger for selektivt at transportere eksempelvis næringsstoffer ind i hjernen og affaldsstoffer ud af hjernen.

Tæt om endothelcellerne findes pericytter og astrocytter, der ved hjælp af signalstoffer regulerer aktiviteten af endothelcellerne og derved blod-hjerne-barrierens gennemtrængelighed. Alle tre celletyper er derfor nødvendige for at opretholde den tætte og selektive barriere, og derfor er det vigtigt, at modeller af blod-hjerne-barrieren indeholder alle tre celletyper i et naturligt forhold.

I laboratoriet måles tætheden af barrieren blandt andet som den transendothele elektriske modstand (transendothelial electrical resistance; TEER),5 som kan måles med to elektroder på hver side af endothelet. Hos raske er blod-hjerne-barrierens TEER omkring 5000 Ωcm2; en værdi man aldrig har opnået i in vitro modeller af blod-hjerne-barrieren.6

Den gode blod-hjerne-barriere-model
Der findes talrige in vitro modeller af blod-hjerne-barrieren, fra simple modeller med et enkelt lag af endothelceller til komplekse tredimensionale strukturer med flere forskellige celletyper. Valget af model styres af, hvad man ønsker at undersøge. Man kan dog generelt sige, at fire egenskaber er særligt vigtige for kvaliteten af en blod-hjerne-barriere-model:

• Den skal have en høj tæthed.
• Den skal udtrykke funktionelle og fysiologisk relevante transportproteiner.
• Den skal have fysiologisk arkitektur.
• Det er en fordel, hvis kulturen af cellerne er simpel.4

I det følgende tager vi udgangspunkt i de fire egenskaber i en beskrivelse af de vigtigste typer af blod-hjerne-barriere-modeller. De forskellige modeller kan både variere i setup og i celletypekomposition. For at læse om flere modeltyper samt en vurdering af disse henviser vi til Lauschke et al. 2017.6

Den simple model
Den mest simple model af blod-hjerne-barrieren bruger én endothelcellelinje ad gangen, samt det såkaldte trans-well system. Trans-well systemet er optimalt til at undersøge tætheden af blod-hjerne-barrieren. Systemet består af en lille cellekulturskål med en filterindsat, der inddeler kulturskålen i en øvre og nedre del. Endothelcellerne gror på filterindsatsen og vil efter nogle dage danne et cellelag, der minder om det, som naturligt findes i blod-hjerne-barrieren. Herefter kan man måle TEER og undersøge forskellige stoffers diffusion imellem de to dele af kultursystemet.

I den mest anvendte trans-well model af blod-hjerne-barrieren bruges endothelcellelinjer, som for eksempel den humane cellelinje hcmec/D3.7,8 Selv om modellen er simpel, hurtig og reproducerbar, giver den kun TEER-værdier omkring 300 Ωcm2.8 En måde at forbedre tætheden på har været at udvikle co- og tripelkulturer, der inkluderer astrocytter og/eller pericytter i trans-well systemet sammen med endothelcellerne.

Forbedrede modeller
Et vigtigt aspekt er, hvor celler kommer fra. Det kan være immortaliserede cellelinjer, primære celler eller celletyper deriverede fra stamceller, og cellerne kan enten komme fra dyr eller mennesker. Der er mange ligheder mellem de mammale cellelinjer, og derfor gør utallige studier brug af cellelinjer fra eksempelvis mus eller grise. Hvis formålet er at lave en model for den humane situation, vil man dog alligevel sidde tilbage med spørgsmålet om, hvor store forskellene mellem arterne egentlig er. Derfor er der stor interesse i at bruge humane celler, når dette er muligt.

Der er flere forskellige kilder til humane celler, men især de senere år har pluripotente stamceller (PSC) været af særlig interesse. Det skyldes, at PSC’er er udifferentierede celler, der har potentialet til at give ophav til alle kroppens celletyper. Det giver mulighed for at danne de relevante humane celletyper, der findes i blod-hjerne-barrieren.

Modeller af blod-hjerne-barrieren, som gør brug af celler deriveret fra PSC’er, har vist sig at være mere fysiologiske. De udtrykker alle de vigtige transportproteiner, udvikler tight junctions og opnår TEER-værdier på nogle tusinde Ωcm2. Ulempen ved disse modeller er, at processen, hvor stamcellerne eksperimentelt stimuleres til at danne de ønskede celletyper, er kompliceret og tidskrævende, fordi den kræver fremragende protokoller, stor ekspertise og gode kontroller for at sikre, at man har produceret den rigtige celletype.

I de senere år har man imidlertid gjort store fremskridt, og det er nu muligt at producere blod-hjerne-barrierens tre celletyper – endothelceller, astrocytter og pericytter – samt at bruge disse i en trans-well blod-hjerne-barriere-model.9-12 En enkelt forskningsgruppe er lykkedes med at skabe en blod-hjerne-barriere-model med alle tre celletyper deriverede fra pluripotente stamceller, og samtidig opnå høje TEER-værdier med trans-well systemet.10,11 Desværre er det indtil nu ikke lykkedes at reproducere resultaterne i andre laboratorier.

Udover cellernes oprindelse og kombinationen af forskellige celletyper kan man også skelne mellem modeller, der gør brug af todimensionelle (2D) eller tredimensionelle (3D) cellekulturer. 2D cellekulturer udgøres af celler, der gror i et enkelt lag, hvorimod 3D cellekulturerne udgøres af celler, der gror i flere lag eller i et komplekst 3D matrix. Den mest anvendte form for 3D cellekultur udgøres af flere lag celler arrangeret i såkaldte hydrogeler som eksempelvis kollagen eller gelatine.

Hydrogeler består af polymere, der er opløst i vand, og de har til funktion at imitere cellens fysiologisk strukturelle omgivelser. Blod-hjerne-barrierens celler, der normalt findes i det bløde hjernevæv, har således behov for et andet omgivende miljø end knogleceller, der normalt findes i mere stive omgivelser. En anden vigtig egenskab ved hydrogelerne er deres evne til at inkorporere vækstfaktorer, signaleringsmolekyler og andre aktive stoffer på en måde, der imiterer det miljø, som omgiver cellerne in vivo. Ikke overraskende har 3D cellekulturer vist sig at være mere relevante for den fysiologiske situation end 2D cellekulturerne.13 Man har i de senere år gjort store fremskridt i udviklingen af hydrogeler, specielt til at forbedre kultur af pluripotente stamceller og de herfra deriverede celletyper.

Håbet er, at hydrogeler skal hjælpe til at integrere endothelceller, pericytter og astrocytter i en 3D struktur, der ligner den, som disse celletyper findes i in vivo, og at dette kan forbedre fremtidens modeller af blod-hjerne-barrieren. Disse 3D strukturer kan bruges i trans-well systemet, men der findes også mange andre systemer til at arrangere cellerne. Dem vil vi dog ikke komme nærmere ind på her.

KONKLUSION
Der er mange modeller at vælge imellem, men det væsentlige er, at man vælger den model af blod-hjerne-barrieren, der bedst kan belyse det problem, man undersøger. Vil man undersøge, hvordan forskellige sygdomme påvirker tætheden af blod-hjerne-barrieren, har man brug for at måle TEER, og det gøres bedst i trans-well systemet. Det samme gælder, hvis man vil analysere hvilke stoffer, der er i stand til at passere blod-hjerne-barrieren, eksempelvis i forbindelse med udvikling af lægemidler, der skal virke i hjernen.

Valget af celletype kan for eksempel afhænge af, hvad man ønsker at studere. Vil man eksempelvis undersøge genetiske sygdomme, er PSC’er et godt valg, da de kan deriveres fra patienter med genetisk nedarvede sygdomme. Er man på den anden side interesseret i at opnå mere generel viden, kan kommercielle cellelinjer give mulighed for simpel cellekultur og reproducerbare resultater.
Original languageEnglish
JournalBestPractice Neurologi
Issue numberJuli
Publication statusPublished - 2018

Cite this

@article{87112b0597064ff28e9db208a966bade,
title = "Cellekulturer danner blod-hjerne-barrieren i laboratoriet",
abstract = "Viden om blod-hjerne-barrierens komposition og gennemtr{\ae}ngelighed er essentiel for udviklingen af l{\ae}gemidler, der skal kunne n{\aa} hjernens celler, men ogs{\aa} for forskning i neurodegenerative sygdomme. Studier indikerer nemlig, at der er sammenh{\ae}ng mellem intaktheden af blod-hjerne-barrieren og sygdomme som eksempelvis vaskul{\ae}r demens, multipel sklerose og Alzheimers sygdom.1-4 Hvorvidt nedbrydning af blod-hjerne-barrieren er {\aa}rsag eller konsekvens vides ikke. Til at unders{\o}ge blod-hjerne-barrieren kr{\ae}ves gode modeller, der kan laves i laboratoriet. Det kan enten v{\ae}re dyremodeller eller modeller baseret p{\aa} celler groet i kultursk{\aa}le – s{\aa}kaldte in vitro modeller. Denne artikel giver et overblik over forskellige eksisterende modeller, samt hvad der skal til for, at vi i fremtiden kan udvikle fysiologisk relevante modeller af blod-hjerne-barrieren. Blod-hjerne-barrierens kompositionBlod-hjerne-barrieren er en t{\ae}t barriere, der adskiller hjernemilj{\o}et fra blodsystemet. Den best{\aa}r af flere forskellige celletyper, der tilsammen har til opgave at selektere, hvilke stoffer der f{\aa}r lov at passere fra blodet og ind i hjernen for at sikre det helt unikke milj{\o}, der kr{\ae}ves for, at hjernens celler kan fungere optimalt. Blod-hjerne-barrierens unikke t{\ae}thed og selektive permeabilitet skyldes tre forskellige celletyper. Det basale cellelag udg{\o}res af specialiserede endothelceller. Disse celler udtrykker s{\ae}rlige proteinkomplekser (tight junctions og adherens junctions) p{\aa} deres laterale overflade, hvilket har til funktion at binde cellerne t{\ae}t sammen og derved skabe en fysisk barriere, der forhindrer molekyler i at passere imellem cellerne fra blodet og ind i hjernev{\ae}vet. I stedet m{\aa} molekylerne passere igennem cellerne ved hj{\ae}lp af forskellige aktive transportmekanismer, der s{\o}rger for selektivt at transportere eksempelvis n{\ae}ringsstoffer ind i hjernen og affaldsstoffer ud af hjernen. T{\ae}t om endothelcellerne findes pericytter og astrocytter, der ved hj{\ae}lp af signalstoffer regulerer aktiviteten af endothelcellerne og derved blod-hjerne-barrierens gennemtr{\ae}ngelighed. Alle tre celletyper er derfor n{\o}dvendige for at opretholde den t{\ae}tte og selektive barriere, og derfor er det vigtigt, at modeller af blod-hjerne-barrieren indeholder alle tre celletyper i et naturligt forhold. I laboratoriet m{\aa}les t{\ae}theden af barrieren blandt andet som den transendothele elektriske modstand (transendothelial electrical resistance; TEER),5 som kan m{\aa}les med to elektroder p{\aa} hver side af endothelet. Hos raske er blod-hjerne-barrierens TEER omkring 5000 Ωcm2; en v{\ae}rdi man aldrig har opn{\aa}et i in vitro modeller af blod-hjerne-barrieren.6 Den gode blod-hjerne-barriere-modelDer findes talrige in vitro modeller af blod-hjerne-barrieren, fra simple modeller med et enkelt lag af endothelceller til komplekse tredimensionale strukturer med flere forskellige celletyper. Valget af model styres af, hvad man {\o}nsker at unders{\o}ge. Man kan dog generelt sige, at fire egenskaber er s{\ae}rligt vigtige for kvaliteten af en blod-hjerne-barriere-model: • Den skal have en h{\o}j t{\ae}thed.• Den skal udtrykke funktionelle og fysiologisk relevante transportproteiner.• Den skal have fysiologisk arkitektur.• Det er en fordel, hvis kulturen af cellerne er simpel.4I det f{\o}lgende tager vi udgangspunkt i de fire egenskaber i en beskrivelse af de vigtigste typer af blod-hjerne-barriere-modeller. De forskellige modeller kan b{\aa}de variere i setup og i celletypekomposition. For at l{\ae}se om flere modeltyper samt en vurdering af disse henviser vi til Lauschke et al. 2017.6Den simple modelDen mest simple model af blod-hjerne-barrieren bruger {\'e}n endothelcellelinje ad gangen, samt det s{\aa}kaldte trans-well system. Trans-well systemet er optimalt til at unders{\o}ge t{\ae}theden af blod-hjerne-barrieren. Systemet best{\aa}r af en lille cellekultursk{\aa}l med en filterindsat, der inddeler kultursk{\aa}len i en {\o}vre og nedre del. Endothelcellerne gror p{\aa} filterindsatsen og vil efter nogle dage danne et cellelag, der minder om det, som naturligt findes i blod-hjerne-barrieren. Herefter kan man m{\aa}le TEER og unders{\o}ge forskellige stoffers diffusion imellem de to dele af kultursystemet. I den mest anvendte trans-well model af blod-hjerne-barrieren bruges endothelcellelinjer, som for eksempel den humane cellelinje hcmec/D3.7,8 Selv om modellen er simpel, hurtig og reproducerbar, giver den kun TEER-v{\ae}rdier omkring 300 Ωcm2.8 En m{\aa}de at forbedre t{\ae}theden p{\aa} har v{\ae}ret at udvikle co- og tripelkulturer, der inkluderer astrocytter og/eller pericytter i trans-well systemet sammen med endothelcellerne. Forbedrede modellerEt vigtigt aspekt er, hvor celler kommer fra. Det kan v{\ae}re immortaliserede cellelinjer, prim{\ae}re celler eller celletyper deriverede fra stamceller, og cellerne kan enten komme fra dyr eller mennesker. Der er mange ligheder mellem de mammale cellelinjer, og derfor g{\o}r utallige studier brug af cellelinjer fra eksempelvis mus eller grise. Hvis form{\aa}let er at lave en model for den humane situation, vil man dog alligevel sidde tilbage med sp{\o}rgsm{\aa}let om, hvor store forskellene mellem arterne egentlig er. Derfor er der stor interesse i at bruge humane celler, n{\aa}r dette er muligt.Der er flere forskellige kilder til humane celler, men is{\ae}r de senere {\aa}r har pluripotente stamceller (PSC) v{\ae}ret af s{\ae}rlig interesse. Det skyldes, at PSC’er er udifferentierede celler, der har potentialet til at give ophav til alle kroppens celletyper. Det giver mulighed for at danne de relevante humane celletyper, der findes i blod-hjerne-barrieren.Modeller af blod-hjerne-barrieren, som g{\o}r brug af celler deriveret fra PSC’er, har vist sig at v{\ae}re mere fysiologiske. De udtrykker alle de vigtige transportproteiner, udvikler tight junctions og opn{\aa}r TEER-v{\ae}rdier p{\aa} nogle tusinde Ωcm2. Ulempen ved disse modeller er, at processen, hvor stamcellerne eksperimentelt stimuleres til at danne de {\o}nskede celletyper, er kompliceret og tidskr{\ae}vende, fordi den kr{\ae}ver fremragende protokoller, stor ekspertise og gode kontroller for at sikre, at man har produceret den rigtige celletype. I de senere {\aa}r har man imidlertid gjort store fremskridt, og det er nu muligt at producere blod-hjerne-barrierens tre celletyper – endothelceller, astrocytter og pericytter – samt at bruge disse i en trans-well blod-hjerne-barriere-model.9-12 En enkelt forskningsgruppe er lykkedes med at skabe en blod-hjerne-barriere-model med alle tre celletyper deriverede fra pluripotente stamceller, og samtidig opn{\aa} h{\o}je TEER-v{\ae}rdier med trans-well systemet.10,11 Desv{\ae}rre er det indtil nu ikke lykkedes at reproducere resultaterne i andre laboratorier. Udover cellernes oprindelse og kombinationen af forskellige celletyper kan man ogs{\aa} skelne mellem modeller, der g{\o}r brug af todimensionelle (2D) eller tredimensionelle (3D) cellekulturer. 2D cellekulturer udg{\o}res af celler, der gror i et enkelt lag, hvorimod 3D cellekulturerne udg{\o}res af celler, der gror i flere lag eller i et komplekst 3D matrix. Den mest anvendte form for 3D cellekultur udg{\o}res af flere lag celler arrangeret i s{\aa}kaldte hydrogeler som eksempelvis kollagen eller gelatine. Hydrogeler best{\aa}r af polymere, der er opl{\o}st i vand, og de har til funktion at imitere cellens fysiologisk strukturelle omgivelser. Blod-hjerne-barrierens celler, der normalt findes i det bl{\o}de hjernev{\ae}v, har s{\aa}ledes behov for et andet omgivende milj{\o} end knogleceller, der normalt findes i mere stive omgivelser. En anden vigtig egenskab ved hydrogelerne er deres evne til at inkorporere v{\ae}kstfaktorer, signaleringsmolekyler og andre aktive stoffer p{\aa} en m{\aa}de, der imiterer det milj{\o}, som omgiver cellerne in vivo. Ikke overraskende har 3D cellekulturer vist sig at v{\ae}re mere relevante for den fysiologiske situation end 2D cellekulturerne.13 Man har i de senere {\aa}r gjort store fremskridt i udviklingen af hydrogeler, specielt til at forbedre kultur af pluripotente stamceller og de herfra deriverede celletyper. H{\aa}bet er, at hydrogeler skal hj{\ae}lpe til at integrere endothelceller, pericytter og astrocytter i en 3D struktur, der ligner den, som disse celletyper findes i in vivo, og at dette kan forbedre fremtidens modeller af blod-hjerne-barrieren. Disse 3D strukturer kan bruges i trans-well systemet, men der findes ogs{\aa} mange andre systemer til at arrangere cellerne. Dem vil vi dog ikke komme n{\ae}rmere ind p{\aa} her.KONKLUSIONDer er mange modeller at v{\ae}lge imellem, men det v{\ae}sentlige er, at man v{\ae}lger den model af blod-hjerne-barrieren, der bedst kan belyse det problem, man unders{\o}ger. Vil man unders{\o}ge, hvordan forskellige sygdomme p{\aa}virker t{\ae}theden af blod-hjerne-barrieren, har man brug for at m{\aa}le TEER, og det g{\o}res bedst i trans-well systemet. Det samme g{\ae}lder, hvis man vil analysere hvilke stoffer, der er i stand til at passere blod-hjerne-barrieren, eksempelvis i forbindelse med udvikling af l{\ae}gemidler, der skal virke i hjernen. Valget af celletype kan for eksempel afh{\ae}nge af, hvad man {\o}nsker at studere. Vil man eksempelvis unders{\o}ge genetiske sygdomme, er PSC’er et godt valg, da de kan deriveres fra patienter med genetisk nedarvede sygdomme. Er man p{\aa} den anden side interesseret i at opn{\aa} mere generel viden, kan kommercielle cellelinjer give mulighed for simpel cellekultur og reproducerbare resultater.",
author = "Karin Lauschke and Schwartz, {Camilla Victoria Lindgren}",
year = "2018",
language = "English",
journal = "BestPractice Neurologi",
number = "Juli",

}

Cellekulturer danner blod-hjerne-barrieren i laboratoriet. / Lauschke, Karin; Schwartz, Camilla Victoria Lindgren.

In: BestPractice Neurologi, No. Juli, 2018.

Research output: Contribution to journalJournal articleResearchpeer-review

TY - JOUR

T1 - Cellekulturer danner blod-hjerne-barrieren i laboratoriet

AU - Lauschke, Karin

AU - Schwartz, Camilla Victoria Lindgren

PY - 2018

Y1 - 2018

N2 - Viden om blod-hjerne-barrierens komposition og gennemtrængelighed er essentiel for udviklingen af lægemidler, der skal kunne nå hjernens celler, men også for forskning i neurodegenerative sygdomme. Studier indikerer nemlig, at der er sammenhæng mellem intaktheden af blod-hjerne-barrieren og sygdomme som eksempelvis vaskulær demens, multipel sklerose og Alzheimers sygdom.1-4 Hvorvidt nedbrydning af blod-hjerne-barrieren er årsag eller konsekvens vides ikke. Til at undersøge blod-hjerne-barrieren kræves gode modeller, der kan laves i laboratoriet. Det kan enten være dyremodeller eller modeller baseret på celler groet i kulturskåle – såkaldte in vitro modeller. Denne artikel giver et overblik over forskellige eksisterende modeller, samt hvad der skal til for, at vi i fremtiden kan udvikle fysiologisk relevante modeller af blod-hjerne-barrieren. Blod-hjerne-barrierens kompositionBlod-hjerne-barrieren er en tæt barriere, der adskiller hjernemiljøet fra blodsystemet. Den består af flere forskellige celletyper, der tilsammen har til opgave at selektere, hvilke stoffer der får lov at passere fra blodet og ind i hjernen for at sikre det helt unikke miljø, der kræves for, at hjernens celler kan fungere optimalt. Blod-hjerne-barrierens unikke tæthed og selektive permeabilitet skyldes tre forskellige celletyper. Det basale cellelag udgøres af specialiserede endothelceller. Disse celler udtrykker særlige proteinkomplekser (tight junctions og adherens junctions) på deres laterale overflade, hvilket har til funktion at binde cellerne tæt sammen og derved skabe en fysisk barriere, der forhindrer molekyler i at passere imellem cellerne fra blodet og ind i hjernevævet. I stedet må molekylerne passere igennem cellerne ved hjælp af forskellige aktive transportmekanismer, der sørger for selektivt at transportere eksempelvis næringsstoffer ind i hjernen og affaldsstoffer ud af hjernen. Tæt om endothelcellerne findes pericytter og astrocytter, der ved hjælp af signalstoffer regulerer aktiviteten af endothelcellerne og derved blod-hjerne-barrierens gennemtrængelighed. Alle tre celletyper er derfor nødvendige for at opretholde den tætte og selektive barriere, og derfor er det vigtigt, at modeller af blod-hjerne-barrieren indeholder alle tre celletyper i et naturligt forhold. I laboratoriet måles tætheden af barrieren blandt andet som den transendothele elektriske modstand (transendothelial electrical resistance; TEER),5 som kan måles med to elektroder på hver side af endothelet. Hos raske er blod-hjerne-barrierens TEER omkring 5000 Ωcm2; en værdi man aldrig har opnået i in vitro modeller af blod-hjerne-barrieren.6 Den gode blod-hjerne-barriere-modelDer findes talrige in vitro modeller af blod-hjerne-barrieren, fra simple modeller med et enkelt lag af endothelceller til komplekse tredimensionale strukturer med flere forskellige celletyper. Valget af model styres af, hvad man ønsker at undersøge. Man kan dog generelt sige, at fire egenskaber er særligt vigtige for kvaliteten af en blod-hjerne-barriere-model: • Den skal have en høj tæthed.• Den skal udtrykke funktionelle og fysiologisk relevante transportproteiner.• Den skal have fysiologisk arkitektur.• Det er en fordel, hvis kulturen af cellerne er simpel.4I det følgende tager vi udgangspunkt i de fire egenskaber i en beskrivelse af de vigtigste typer af blod-hjerne-barriere-modeller. De forskellige modeller kan både variere i setup og i celletypekomposition. For at læse om flere modeltyper samt en vurdering af disse henviser vi til Lauschke et al. 2017.6Den simple modelDen mest simple model af blod-hjerne-barrieren bruger én endothelcellelinje ad gangen, samt det såkaldte trans-well system. Trans-well systemet er optimalt til at undersøge tætheden af blod-hjerne-barrieren. Systemet består af en lille cellekulturskål med en filterindsat, der inddeler kulturskålen i en øvre og nedre del. Endothelcellerne gror på filterindsatsen og vil efter nogle dage danne et cellelag, der minder om det, som naturligt findes i blod-hjerne-barrieren. Herefter kan man måle TEER og undersøge forskellige stoffers diffusion imellem de to dele af kultursystemet. I den mest anvendte trans-well model af blod-hjerne-barrieren bruges endothelcellelinjer, som for eksempel den humane cellelinje hcmec/D3.7,8 Selv om modellen er simpel, hurtig og reproducerbar, giver den kun TEER-værdier omkring 300 Ωcm2.8 En måde at forbedre tætheden på har været at udvikle co- og tripelkulturer, der inkluderer astrocytter og/eller pericytter i trans-well systemet sammen med endothelcellerne. Forbedrede modellerEt vigtigt aspekt er, hvor celler kommer fra. Det kan være immortaliserede cellelinjer, primære celler eller celletyper deriverede fra stamceller, og cellerne kan enten komme fra dyr eller mennesker. Der er mange ligheder mellem de mammale cellelinjer, og derfor gør utallige studier brug af cellelinjer fra eksempelvis mus eller grise. Hvis formålet er at lave en model for den humane situation, vil man dog alligevel sidde tilbage med spørgsmålet om, hvor store forskellene mellem arterne egentlig er. Derfor er der stor interesse i at bruge humane celler, når dette er muligt.Der er flere forskellige kilder til humane celler, men især de senere år har pluripotente stamceller (PSC) været af særlig interesse. Det skyldes, at PSC’er er udifferentierede celler, der har potentialet til at give ophav til alle kroppens celletyper. Det giver mulighed for at danne de relevante humane celletyper, der findes i blod-hjerne-barrieren.Modeller af blod-hjerne-barrieren, som gør brug af celler deriveret fra PSC’er, har vist sig at være mere fysiologiske. De udtrykker alle de vigtige transportproteiner, udvikler tight junctions og opnår TEER-værdier på nogle tusinde Ωcm2. Ulempen ved disse modeller er, at processen, hvor stamcellerne eksperimentelt stimuleres til at danne de ønskede celletyper, er kompliceret og tidskrævende, fordi den kræver fremragende protokoller, stor ekspertise og gode kontroller for at sikre, at man har produceret den rigtige celletype. I de senere år har man imidlertid gjort store fremskridt, og det er nu muligt at producere blod-hjerne-barrierens tre celletyper – endothelceller, astrocytter og pericytter – samt at bruge disse i en trans-well blod-hjerne-barriere-model.9-12 En enkelt forskningsgruppe er lykkedes med at skabe en blod-hjerne-barriere-model med alle tre celletyper deriverede fra pluripotente stamceller, og samtidig opnå høje TEER-værdier med trans-well systemet.10,11 Desværre er det indtil nu ikke lykkedes at reproducere resultaterne i andre laboratorier. Udover cellernes oprindelse og kombinationen af forskellige celletyper kan man også skelne mellem modeller, der gør brug af todimensionelle (2D) eller tredimensionelle (3D) cellekulturer. 2D cellekulturer udgøres af celler, der gror i et enkelt lag, hvorimod 3D cellekulturerne udgøres af celler, der gror i flere lag eller i et komplekst 3D matrix. Den mest anvendte form for 3D cellekultur udgøres af flere lag celler arrangeret i såkaldte hydrogeler som eksempelvis kollagen eller gelatine. Hydrogeler består af polymere, der er opløst i vand, og de har til funktion at imitere cellens fysiologisk strukturelle omgivelser. Blod-hjerne-barrierens celler, der normalt findes i det bløde hjernevæv, har således behov for et andet omgivende miljø end knogleceller, der normalt findes i mere stive omgivelser. En anden vigtig egenskab ved hydrogelerne er deres evne til at inkorporere vækstfaktorer, signaleringsmolekyler og andre aktive stoffer på en måde, der imiterer det miljø, som omgiver cellerne in vivo. Ikke overraskende har 3D cellekulturer vist sig at være mere relevante for den fysiologiske situation end 2D cellekulturerne.13 Man har i de senere år gjort store fremskridt i udviklingen af hydrogeler, specielt til at forbedre kultur af pluripotente stamceller og de herfra deriverede celletyper. Håbet er, at hydrogeler skal hjælpe til at integrere endothelceller, pericytter og astrocytter i en 3D struktur, der ligner den, som disse celletyper findes i in vivo, og at dette kan forbedre fremtidens modeller af blod-hjerne-barrieren. Disse 3D strukturer kan bruges i trans-well systemet, men der findes også mange andre systemer til at arrangere cellerne. Dem vil vi dog ikke komme nærmere ind på her.KONKLUSIONDer er mange modeller at vælge imellem, men det væsentlige er, at man vælger den model af blod-hjerne-barrieren, der bedst kan belyse det problem, man undersøger. Vil man undersøge, hvordan forskellige sygdomme påvirker tætheden af blod-hjerne-barrieren, har man brug for at måle TEER, og det gøres bedst i trans-well systemet. Det samme gælder, hvis man vil analysere hvilke stoffer, der er i stand til at passere blod-hjerne-barrieren, eksempelvis i forbindelse med udvikling af lægemidler, der skal virke i hjernen. Valget af celletype kan for eksempel afhænge af, hvad man ønsker at studere. Vil man eksempelvis undersøge genetiske sygdomme, er PSC’er et godt valg, da de kan deriveres fra patienter med genetisk nedarvede sygdomme. Er man på den anden side interesseret i at opnå mere generel viden, kan kommercielle cellelinjer give mulighed for simpel cellekultur og reproducerbare resultater.

AB - Viden om blod-hjerne-barrierens komposition og gennemtrængelighed er essentiel for udviklingen af lægemidler, der skal kunne nå hjernens celler, men også for forskning i neurodegenerative sygdomme. Studier indikerer nemlig, at der er sammenhæng mellem intaktheden af blod-hjerne-barrieren og sygdomme som eksempelvis vaskulær demens, multipel sklerose og Alzheimers sygdom.1-4 Hvorvidt nedbrydning af blod-hjerne-barrieren er årsag eller konsekvens vides ikke. Til at undersøge blod-hjerne-barrieren kræves gode modeller, der kan laves i laboratoriet. Det kan enten være dyremodeller eller modeller baseret på celler groet i kulturskåle – såkaldte in vitro modeller. Denne artikel giver et overblik over forskellige eksisterende modeller, samt hvad der skal til for, at vi i fremtiden kan udvikle fysiologisk relevante modeller af blod-hjerne-barrieren. Blod-hjerne-barrierens kompositionBlod-hjerne-barrieren er en tæt barriere, der adskiller hjernemiljøet fra blodsystemet. Den består af flere forskellige celletyper, der tilsammen har til opgave at selektere, hvilke stoffer der får lov at passere fra blodet og ind i hjernen for at sikre det helt unikke miljø, der kræves for, at hjernens celler kan fungere optimalt. Blod-hjerne-barrierens unikke tæthed og selektive permeabilitet skyldes tre forskellige celletyper. Det basale cellelag udgøres af specialiserede endothelceller. Disse celler udtrykker særlige proteinkomplekser (tight junctions og adherens junctions) på deres laterale overflade, hvilket har til funktion at binde cellerne tæt sammen og derved skabe en fysisk barriere, der forhindrer molekyler i at passere imellem cellerne fra blodet og ind i hjernevævet. I stedet må molekylerne passere igennem cellerne ved hjælp af forskellige aktive transportmekanismer, der sørger for selektivt at transportere eksempelvis næringsstoffer ind i hjernen og affaldsstoffer ud af hjernen. Tæt om endothelcellerne findes pericytter og astrocytter, der ved hjælp af signalstoffer regulerer aktiviteten af endothelcellerne og derved blod-hjerne-barrierens gennemtrængelighed. Alle tre celletyper er derfor nødvendige for at opretholde den tætte og selektive barriere, og derfor er det vigtigt, at modeller af blod-hjerne-barrieren indeholder alle tre celletyper i et naturligt forhold. I laboratoriet måles tætheden af barrieren blandt andet som den transendothele elektriske modstand (transendothelial electrical resistance; TEER),5 som kan måles med to elektroder på hver side af endothelet. Hos raske er blod-hjerne-barrierens TEER omkring 5000 Ωcm2; en værdi man aldrig har opnået i in vitro modeller af blod-hjerne-barrieren.6 Den gode blod-hjerne-barriere-modelDer findes talrige in vitro modeller af blod-hjerne-barrieren, fra simple modeller med et enkelt lag af endothelceller til komplekse tredimensionale strukturer med flere forskellige celletyper. Valget af model styres af, hvad man ønsker at undersøge. Man kan dog generelt sige, at fire egenskaber er særligt vigtige for kvaliteten af en blod-hjerne-barriere-model: • Den skal have en høj tæthed.• Den skal udtrykke funktionelle og fysiologisk relevante transportproteiner.• Den skal have fysiologisk arkitektur.• Det er en fordel, hvis kulturen af cellerne er simpel.4I det følgende tager vi udgangspunkt i de fire egenskaber i en beskrivelse af de vigtigste typer af blod-hjerne-barriere-modeller. De forskellige modeller kan både variere i setup og i celletypekomposition. For at læse om flere modeltyper samt en vurdering af disse henviser vi til Lauschke et al. 2017.6Den simple modelDen mest simple model af blod-hjerne-barrieren bruger én endothelcellelinje ad gangen, samt det såkaldte trans-well system. Trans-well systemet er optimalt til at undersøge tætheden af blod-hjerne-barrieren. Systemet består af en lille cellekulturskål med en filterindsat, der inddeler kulturskålen i en øvre og nedre del. Endothelcellerne gror på filterindsatsen og vil efter nogle dage danne et cellelag, der minder om det, som naturligt findes i blod-hjerne-barrieren. Herefter kan man måle TEER og undersøge forskellige stoffers diffusion imellem de to dele af kultursystemet. I den mest anvendte trans-well model af blod-hjerne-barrieren bruges endothelcellelinjer, som for eksempel den humane cellelinje hcmec/D3.7,8 Selv om modellen er simpel, hurtig og reproducerbar, giver den kun TEER-værdier omkring 300 Ωcm2.8 En måde at forbedre tætheden på har været at udvikle co- og tripelkulturer, der inkluderer astrocytter og/eller pericytter i trans-well systemet sammen med endothelcellerne. Forbedrede modellerEt vigtigt aspekt er, hvor celler kommer fra. Det kan være immortaliserede cellelinjer, primære celler eller celletyper deriverede fra stamceller, og cellerne kan enten komme fra dyr eller mennesker. Der er mange ligheder mellem de mammale cellelinjer, og derfor gør utallige studier brug af cellelinjer fra eksempelvis mus eller grise. Hvis formålet er at lave en model for den humane situation, vil man dog alligevel sidde tilbage med spørgsmålet om, hvor store forskellene mellem arterne egentlig er. Derfor er der stor interesse i at bruge humane celler, når dette er muligt.Der er flere forskellige kilder til humane celler, men især de senere år har pluripotente stamceller (PSC) været af særlig interesse. Det skyldes, at PSC’er er udifferentierede celler, der har potentialet til at give ophav til alle kroppens celletyper. Det giver mulighed for at danne de relevante humane celletyper, der findes i blod-hjerne-barrieren.Modeller af blod-hjerne-barrieren, som gør brug af celler deriveret fra PSC’er, har vist sig at være mere fysiologiske. De udtrykker alle de vigtige transportproteiner, udvikler tight junctions og opnår TEER-værdier på nogle tusinde Ωcm2. Ulempen ved disse modeller er, at processen, hvor stamcellerne eksperimentelt stimuleres til at danne de ønskede celletyper, er kompliceret og tidskrævende, fordi den kræver fremragende protokoller, stor ekspertise og gode kontroller for at sikre, at man har produceret den rigtige celletype. I de senere år har man imidlertid gjort store fremskridt, og det er nu muligt at producere blod-hjerne-barrierens tre celletyper – endothelceller, astrocytter og pericytter – samt at bruge disse i en trans-well blod-hjerne-barriere-model.9-12 En enkelt forskningsgruppe er lykkedes med at skabe en blod-hjerne-barriere-model med alle tre celletyper deriverede fra pluripotente stamceller, og samtidig opnå høje TEER-værdier med trans-well systemet.10,11 Desværre er det indtil nu ikke lykkedes at reproducere resultaterne i andre laboratorier. Udover cellernes oprindelse og kombinationen af forskellige celletyper kan man også skelne mellem modeller, der gør brug af todimensionelle (2D) eller tredimensionelle (3D) cellekulturer. 2D cellekulturer udgøres af celler, der gror i et enkelt lag, hvorimod 3D cellekulturerne udgøres af celler, der gror i flere lag eller i et komplekst 3D matrix. Den mest anvendte form for 3D cellekultur udgøres af flere lag celler arrangeret i såkaldte hydrogeler som eksempelvis kollagen eller gelatine. Hydrogeler består af polymere, der er opløst i vand, og de har til funktion at imitere cellens fysiologisk strukturelle omgivelser. Blod-hjerne-barrierens celler, der normalt findes i det bløde hjernevæv, har således behov for et andet omgivende miljø end knogleceller, der normalt findes i mere stive omgivelser. En anden vigtig egenskab ved hydrogelerne er deres evne til at inkorporere vækstfaktorer, signaleringsmolekyler og andre aktive stoffer på en måde, der imiterer det miljø, som omgiver cellerne in vivo. Ikke overraskende har 3D cellekulturer vist sig at være mere relevante for den fysiologiske situation end 2D cellekulturerne.13 Man har i de senere år gjort store fremskridt i udviklingen af hydrogeler, specielt til at forbedre kultur af pluripotente stamceller og de herfra deriverede celletyper. Håbet er, at hydrogeler skal hjælpe til at integrere endothelceller, pericytter og astrocytter i en 3D struktur, der ligner den, som disse celletyper findes i in vivo, og at dette kan forbedre fremtidens modeller af blod-hjerne-barrieren. Disse 3D strukturer kan bruges i trans-well systemet, men der findes også mange andre systemer til at arrangere cellerne. Dem vil vi dog ikke komme nærmere ind på her.KONKLUSIONDer er mange modeller at vælge imellem, men det væsentlige er, at man vælger den model af blod-hjerne-barrieren, der bedst kan belyse det problem, man undersøger. Vil man undersøge, hvordan forskellige sygdomme påvirker tætheden af blod-hjerne-barrieren, har man brug for at måle TEER, og det gøres bedst i trans-well systemet. Det samme gælder, hvis man vil analysere hvilke stoffer, der er i stand til at passere blod-hjerne-barrieren, eksempelvis i forbindelse med udvikling af lægemidler, der skal virke i hjernen. Valget af celletype kan for eksempel afhænge af, hvad man ønsker at studere. Vil man eksempelvis undersøge genetiske sygdomme, er PSC’er et godt valg, da de kan deriveres fra patienter med genetisk nedarvede sygdomme. Er man på den anden side interesseret i at opnå mere generel viden, kan kommercielle cellelinjer give mulighed for simpel cellekultur og reproducerbare resultater.

M3 - Journal article

JO - BestPractice Neurologi

JF - BestPractice Neurologi

IS - Juli

ER -